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从“看不见”到“看见病毒入侵”——显微技术如何一步步解密流感？

随着冬季气温下降，流感疫情又将蠢蠢欲动。所幸得益于显微技术的进步，科学家们在百年前“看见”流感病毒，现在进而拆解流感病毒进入细胞的动态过程，希望能进一步研发更有效的抗病毒疗法。

流感是感染人类流感病毒所引发的急性病毒性呼吸道疾病，常引起发烧、咳嗽、头痛、肌肉酸痛、疲倦、流鼻水、喉咙痛等，多数国家每年均会发生周期性流行。

看不见的敌人，横扫全球

除了周期性的地区流行，流感也曾出现大规模疫情，造成世界性大流行。其中1918年流感大流行（又称西班牙流感）最为严重，导致全球数千万人死亡。

1918年正值第一次世界大战，美军在主要入境港口之一，法国的布列斯特（Brest）首次出现流感疫情;4月中旬，波尔多军医院也出现了疫情。这些疫情持续时间短暂且无害，死亡人数很少，士兵们很快就从所谓的“三日热”（the three-day fever）中恢复。

之后，法国和英国部队也陆续出现流感病例，位于法国圣纳泽尔（Saint-Nazaire）的年轻士兵成群感染。1918年5月疫情扩散至索姆河前线（Somme）和洛林地区（Lorraine），前线每天报告新增1500至2000名病例。巴黎于6月受到影响，疫情持续蔓延至英国、德国、意大利，西班牙也未能倖免。

但当时第一次世界大战的主要参战国家，如德、英、法、美等国为了避免影响士气，严格管制媒体报道疫情。然而保持中立而未参战的西班牙，因为没有实施战时审查制度，西班牙媒体自由报道着流感相关新闻，甚至连西班牙国王阿方索十三世（King Alfonso XIII）感染重症的消息也被广泛报道，造成西班牙疫情特别严重的错觉，也因此被命名为“西班牙流感”。

1918年5月28日《太阳报》的头条新闻，内容为：马德里三日热病肆虐，八万人罹病，国王陛下病重。图片来源：Wiki

经由战争和海运，疫情扩散至全球，西班牙流感出现三波疫情高峰。第一波发生于1918年春季;到了1918年秋季，出现第二波疫情，是死亡率最高的一波;第三波则发生于1919年冬季至1920年春季，死亡率介于第一波和第二波之间。1918到1920年，估计西班牙流感造成全球约5000万人死亡。

虽然流感造成的死亡人数更甚于一战死亡人数，但人们还不清楚流行性感冒是由什么病原体造成。许多科学家开始积极投入假定病原体的研究，大量患者体内存在流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，前称费弗氏桿菌Pfeiffer’s bacillus），但也有些病患体内无法分离出病菌，无法满足柯霍式法则的条件。不过当时流感嗜血桿菌仍被认定是流感的病原体。

柯霍氏法则（Koch’s postulates）：

病体罹病部位经常可以找到大量的病原体，而在健康活体中找不到这些病原体。

病原体可被分离并在培养基中进行培养，并记录各项特征。

纯粹培养的病原体应该接种至与病株相同品种的健康植株，并产生与病株相同的病征。

从接种的病株上以相同的分离方法应能再分离出病原体，且其特征与由原病株分离者应完全相同。

直到1933年，英国科学家史密斯（Wilson Smith）、安德鲁（Christopher Andrewes）和莱德劳（Patrick Laidlaw）在伦敦国家医学研究所（NIMR）分离并鉴定出人类A型流感病毒。他们在流感患者身上收集鼻涕和喉咙漱口液，过滤后滴入雪貂体内。之后雪貂开始打喷嚏并出现类似流感的症状，并且传染给同一笼的雪貂。他们证明了这种感染是可重复的，显示该病原具感染性，而不是偶然。

1936年，一名年轻的伦敦国家医学研究所研究员意外接触到已感染流感病毒的雪貂的喷嚏分泌物。两天后，他也出现流感症状，并在喉咙分离出病毒，血清出现特定抗体。这次意外完成的传播链，实现了柯霍氏法则第三条。之后，B型和C型流感病毒也分别在1940年、1947年被陆续分离出来。

揭开纳米级真实样貌

尽管此时人们已经知道流感的病原体是可过滤、体积比细菌小的病毒，但一直没有“见到本尊”。

1931年德国科学家克诺尔（Max Knoll）与鲁斯卡（Ernst Ruska）合力制作并发表了史上第一台电子显微镜。电子显微镜以电子束取代光来观察物体，由于电子波长短于可见光，解析度提升到纳米等级，也使得病毒得以现形。

用电子显微镜观察，流感病毒呈现球形或丝状;球形病毒的直径约100纳米，丝状病毒的长度则通常超过300纳米。

在电子显微镜下，其实很难仅靠外观分辨A型和B型流感病毒。A型流感病毒的最外层是一层来自宿主细胞的脂质膜，就像穿上“外套”一样。套膜外则有明显的尖钉（spikes）构造，就像布满尖刺的球体。这些“尖刺”主要由两种醣蛋白组成：血凝素（HA）和神经胺酸酶（NA），是流感病毒感染能力的关键，也正是H1N1、H3N2等亚型命名的由来。

病毒外壳上还零星分布M2离子通道蛋白（M2 ion channel protein），但数量非常少，平均每100至200个HA，才有一个M2。套膜下则有M1基质蛋白（matrix protein M1）支撑病毒结构，维持病毒稳定。B型流感病毒的整体结构和A型非常类似，只是膜蛋白组成略有不同，除了HA和NA之外，另有两种B型流感独有的NB和BM2蛋白。至于C型流感病毒，外型就和A、B型明显不同，它们在感染细胞表面时，能形成长达数百微米的“绳索状结构”。

然而，电子显微镜有其限制：样本必须固定、脱水，只能看到“结果”，而非“过程”。虽然随着萤光标记与活细胞显微术的进步，研究者也开始追踪流感病毒在细胞内的移动路径。但萤光显微镜看到的是标记讯号，而非病毒的真实形貌;病毒如何与细胞膜互动、是否造成结构变形，仍多半停留在推测层次。

（左）穿透式电子显微镜（TEM）下所见的流感病毒颗粒，周围环绕明显的钉突;（右）流感病毒的3D模型。图片来源：美国CDC Public Health Image Library （PHIL）

以“病毒视角”看流感病毒互动

苏黎世联邦理工学院分子医学教授山内洋平（Yohei Yamauchi）带领的研究团队，使用改良的“病毒视角”原子力显微镜（virus-view atomic force microscopy），首次在活细胞表面即时观察到单颗A型流感病毒进入细胞的过程。

原子力显微镜是以纳米探针，在样本表面扫描，透过感测微小的力学变化来重建样本形貌。研究团队将原子力显微镜与共轭焦萤光显微镜整合，一边确认颗粒的“身份”，一边记录其造成的细胞膜变形。

他们看到流感病毒在细胞表面并非立刻被吞噬，而是先停留一段时间，并在接触处诱导细胞膜产生局部下陷。慢慢地病毒被细胞膜包覆，最终完成内吞。结果显示病毒不是“自行闯入”，细胞也“主动”参与反应。细胞将对内吞作用重要的网格蛋白（clathrin protein）聚集到病毒所在的位置，细胞表面也会在病毒所在位置隆起，把病毒“往内拉”。如果病毒远离细胞表面，这种波浪状的膜运动也会增强，仿佛细胞要把病毒“抓回来”一般。

从光学显微镜的“看不见”，到电子显微镜的“看见结构”，再到原子力显微镜的“看见动态互动”，显微技术的演进不只是解析度的提升，更不断改变人们对流感病毒的理解，进一步为疾病研究和防治开启新的可能。

“病毒视角”显微镜（ViViD-AFM）示意图及观察病毒互动影像。图片来源：Yohei Yamauchi团队论文

参考资料：

Bouvier, N. M., & Palese, P. （2008）. The biology of influenza viruses. Vaccine, 26 Suppl 4（Suppl 4）, D49–D53.

Berche P. （2022）. The Spanish flu. Presse medicale （Paris, France : 1983）, 51（3）, 104127.

Yoshida, A., Uekusa, Y., Suzuki, T., Bauer, M., Sakai, N., & Yamauchi, Y. （2025）. Enhanced visualization of influenza A virus entry into living cells using virus-view atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 122（38）, e2500660122.

A year-round disease affecting everyone. WHO